白挨泉¹,王晓清²,甄劲松¹,王淑敏¹

(1.广东省佛山科技学院生命科学院，佛山 528231；2. 梅里亚动物保健有限公司北京分公司，北京 100028)

摘要：本研究采用猪伪狂犬病毒野毒抗体ELISA诊断方法对广东6个集约化猪场不同日龄的364份猪血清进行检测，结果是平均阳性率为54.1%，其中6个场的野毒抗体最低为0%，最高为90%

关键词： 伪狂犬野毒；阳性率；血清学调查

伪狂犬病（pseudorabies）是由伪狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）引起的各种家畜和野生动物的一种急性病。伪狂犬病毒（PRV）属疱疹病毒科，猪疱疹病毒Ⅰ型，只有一种血清型。病毒的抵抗力较强，但对热、甲醛、乙醚和紫外线都很敏感。伪狂犬病特征为发热、奇痒、呼吸和神经系统障碍，猪无明显的瘙痒症状。成猪常呈隐性经过，很少死亡，是PRV最主要的贮存宿主和传染源。母猪感染后，可发生流产、木乃伊胎儿、死胎等一系列繁殖障碍症状。青年母猪和空怀母猪常出现返情、屡配不孕或不发情。公猪常出现睾丸肿胀、萎缩、性能下降，失去种用能力。育肥猪出现严重呼吸道症状，生产缓滞，饲料报酬降低。本病对新生仔猪危害最大，除发热、精神萎顿、运动不协调和痉挛外，还可见呕吐、腹泻，病死率高达80﹪～100﹪。本病一年四季均可发生，但以冬春两季和产仔旺季多发。往往在分娩高峰的母猪舍先发病，几乎每窝都发病，发病率达100﹪，但发病和死亡有1个高峰，以后逐渐减少。另外PRV感染猪只可终生带毒，因此PR对养猪业造成的经济损失相当严重。

伪狂犬病1813年就存在于美国，但直到1902年Aujesjky才将其与狂犬病区分开并定为一种独立的疾病。20世纪中期，伪狂犬病在东欧及巴尔干半岛的国家流行较广，60年代之前，猪被感染后其症状比较温和，在养猪业中未造成重大经济损失。然而在20世纪60～70年代，由于强毒株的出现，猪场爆发伪狂犬病的数量显著增加，而且各种日龄的猪均可感染，其症状明显加剧。我国自1947年首次报道以来，已有多个省市有本病的流行，近年有流行扩大的趋势。疫苗接种虽可降低该病的发生率，减少病毒的扩散，但并不能完全阻止野毒的感染和排毒。为掌握伪狂犬病野毒在广东省养猪场的感染比例，从而得出伪狂犬野毒对养猪生产的危害性，为防治伪狂犬病作出合理的评估。我们应用ELISA法对广东部分注射了伪狂犬基因缺失苗的集约化猪场进行了猪伪狂犬野毒感染的血清学调查。

1.     材料和方法

1.1 材料

1.1.1 待检血清广东6个集约化养猪场的不同批次、不同育龄的364份猪（均已免疫伪狂犬基因缺失苗）的血清；

1.1.2 检测试剂猪伪狂犬野毒抗体ELISA诊断试剂盒（批号：09836-106KY，美国艾迪氏公司），包括已包被好抗原的96孔酶联反应板，标准阴、阳性血清，辣根过氧化物酶（HRPO），TMB底物溶液，终止液，稀释液，洗涤液等；

1.1.3 仪器酶标检测仪。

1.2 方法 采用ELISA法

1.2.1 被检血清的稀释：取50μl血清，加入50μl稀释液中混匀，待检；

1.2.2 除空白对照孔外，每孔加入100μl（1：2）的稀释血清，同样以1：2稀释对照血清，设阳性对照2孔，阴性对照3孔，空白孔不加，轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置室温1h；

1.2.3 甩掉孔中的溶液，用洗涤液洗板3～5次，300μl∕孔，最后一次拍干；

1.2.4 每孔加酶标二抗—辣根过氧化物酶100μl，置室温20min；

1.2.5 洗涤3～5次，方法同1.2.3；

1.2.6 每孔加TMB底物100μl，置室温15min；

1.2.7 每孔加终止液50μl；

1.2.8 结果判定：以空白孔调零，在酶标仪上测各孔OD₆₅₀值。通过计算样品与阴性对照的比例（S/N）来确定伪狂犬野毒抗体的有无。

S/N=样品OD₆₅₀值/阴性对照平均OD₆₅₀值

注：①S/N≥0.6，样品确定为阳性；②S/N＞0.7，样品确定为阴性；③0.6＜S/N≤0.7，样品为可疑。

2 结果

2.1 各场各批次各类别猪伪狂犬病毒野毒感染的检测结果如表1～6。

表1 A场各批次各类别猪伪狂犬野毒感染的检测结果

表2  B场各批次各类别猪伪狂犬野毒感染的检测结果

表3  C场各批次各类别猪伪狂犬野毒感染的检测结果

表4  D场各批次各类别猪伪狂犬野毒感染的检测结果

表5  E场各批次各类别猪伪狂犬野毒感染的检测结果

注：批次1～2猪血清采自新场，平均阳性率88.3﹪，批次3～8猪血清采自旧场，平均阳性率51.7﹪，新旧两猪场野毒阳性率差异极显著（P＜0.01）。

表6  F场各批次各类别猪伪狂犬野毒感染的检测结果

注：批次1～4猪血清采自新场，平均阳性率55.8﹪，批次5～6猪血清采自旧场，平均阳性率85﹪，两猪场野毒阳性率差异极显著（P＜0.01）。

2.2 各场猪伪狂犬病毒野毒感染的检测结果总体统计表如表7：

表7  各场各批次各类别猪伪狂犬野毒感染的检测结果

3 讨论

本次试验是为了掌握伪狂犬病毒野毒在广东省养猪场中的感染比例，从而得出伪狂犬对养猪生产的危害，为防治为狂犬病作出合理的评估，所以本次调查所用的猪血清样品采自广东部分集约化养猪场，各场均进行了伪狂犬基因缺失苗的免疫。当猪接种了缺失编码某一特定糖蛋白的基因缺失疫苗后，将产生缺少该糖蛋白的抗体，而猪一旦感染野毒后，会产生针对所有蛋白（抗原）的抗体，从而可与野毒抗体相区别，所以应用猪伪狂犬野毒抗体ELISA诊断试剂盒就能准确地检测出野毒抗体。我们运用ELISA作为试验方法是由于：①灵敏度和可测范围比放射免疫高5～10倍；②ELISA使用2种抗体，一种作固相抗体，一种作酶标抗体，被测抗原可同时与2种抗体结合，夹在2种抗体之间，明显提高了测定的特异性；③反应迅速，采用短期保温即可。上述优点使ELISA成为具有高度特异性和灵敏度、简便快速、准确可靠和便于自动化的免疫检测技术，应用广泛。

本次被检的6个猪场中有4个场伪狂犬野毒感染为阳性，表明伪狂犬病毒野毒在广东省猪场中的感染率差异显著。而伪狂犬野毒都呈阳性的4个场的阳性率差异同样显著（E场和F场差异不显著，P＞0.05），A场感染率为90﹪，B场感染率为14.3﹪。这可能与各场的环境、管理体系、防疫措施等条件有关，但总体来说感染率也达54.1﹪。从这次调查的结果我们可以知道猪伪狂犬病毒野毒在广东省猪场普遍存在，虽然各场感染率有所差异，危害程度不同，但总的来说危害性还是比较严重，应引起重视。

从本次调查的结果来看，几个地区的6个猪场有4个场伪狂犬野毒为阳性，达66.7﹪，造成被检猪场如此高的阳性率的原因可能有4方面：①猪是伪狂犬病毒最主要的贮存宿主和传染源，虽然调查的6个场均已进行了猪伪狂犬基因缺失苗免疫，对预防伪狂犬野毒起一定作用，但在外界不良环境刺激等造成的免疫力减弱时，潜伏状态的病毒仍可转化为具有感染性的病毒。例如猪舍饲养密度较大、空气流通不良、造成舍内经常有积水、猪场制定的消毒计划不合理等，都容易造成病毒的激化和传播（如A场）。②伪狂犬病毒可通过胎盘垂直传递给后代，而母体免疫球蛋白却不能，所以对胎儿的感染是致命的（如A场）。③引进种猪频繁的同时检疫技术和隔离工作没有相应跟上，且因对该病流行情况认识不足，常误诊为猪瘟或其他疫病（如E场、F场的新旧场差异）。④带有伪狂犬病毒的空气飞沫核可随风传到9km或更远的地方，使健康猪群受到感染。被污染的饲料或带病毒的鼠、犬等动物也可传播。

通过本次调查已发现猪伪狂犬野毒感染的严重性和普遍性，因此应提高重视，加强防治。①制定1个适合本场的免疫程序，对母猪采取免疫使之处于高抗体水平，仔猪通过乳汁获得被动免疫。基因缺失苗既能够有效预防伪狂犬病的隐性感染的发生，对各个年龄的猪群均安全，而且病毒不会垂直传播，对怀孕母猪接种也安全。病毒株遗传性能稳定，无毒力返强现象。②做好免疫工作的同时，对新引进的种猪，要进行严格的检疫。必须是从无伪狂犬病的猪场引进，引进后，须隔离饲养7d，经检疫无疫方可与本场其它猪混群饲养。同时每半年作一次检查。对于检测出的野毒感染阳性猪要严格隔离淘汰，就地处理，最好通过自繁自养来净化猪群。③猪场要定期对猪舍、栏圈等用2%的氢氧化钠溶液或酚类消毒剂进行定期的清洗消毒，同时最好是选择在气候干燥和具有阳光照射下进行效果最佳。④猪场严禁养狗、猫、鸡等，严禁狗、猫、鸡和其它鸟类及动物进入猪舍，同时在猪场内要进行严格的灭鼠措施，以防止鼠类带毒传播疾病。

4 小结

①广东省部分集约化猪场伪狂犬野毒感染率达54.1﹪，危害性较大。各猪场阳性率差异显著，与环境、管理体系和防疫措施等有关系；②因为基因缺失苗所产生的抗体能与野毒抗体相区别，所以运用猪伪狂犬野毒抗体ELISA诊断试剂盒能比较准确地检测出野毒抗体，试验结果比较准确、可信。

参考文献

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