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仔猪腹泻综合征(NPDS)初步研究
http://www.zbxgx.com | 时间:2012-11-20 08:41:35 | 关注人次[] | 字体设置:

韩健宝  南京农业大学动物医学院

邓小红  扬州大学兽医学院

一、 病料处理

分别取解冻的待检病料10g 左右(在冰上进行操作),用灭菌的手术剪剪碎,加入适量的生理盐水或PBS 溶液(pH7.2)混匀,用灭菌的研磨器充分研磨,再用2ml Eppedorf 管分装,反复冻融2-3 次,4℃冷冻离心机离心8000r/m,10min,取上清液,置-70℃保存备用。

二、 病毒液、病料中病原DNA 模板的制备

2.1 圆环病毒及伪狂犬病毒的DNA 提取

取447.5ul 上清液,加50uL10%的SDS,震荡混匀;加入2.5uL 蛋白酶(PEK),混匀;放入58℃水浴锅中,充分裂解2h,再加入水饱和酚250ul,三氯甲烷240ul,异丙醇10ul,混匀,12000 转/分离心5min;取上清400ul加1/10 体积的醋酸钠40ul,2 倍体积的无水乙醇800ul,混匀,置于-20℃进行DNA 沉淀1h;12000r/m 离心20min,弃去上清,加入1000ul 70%乙醇洗涤沉淀,再弃去上清进行干燥,干燥后加入灭菌双蒸水50ul 将DNA 溶解,-20℃保存备用。

2.2 猪瘟病毒、蓝耳病病毒及轮状病毒的RNA 提取及反转录

采用天泽基因生产的柱式动物RNAout 试剂盒提取样品RNA。按照说明书提取,样品管中A 液和B 液各加450ul,再加入300ul 样品上清液,混匀;加氯仿250ul,混匀,12000r/m 离心5min,取700uL 无色透明水相于通用离心柱中,12000r/m 离心1min,加入通用洗柱液700ul,再重复离心步骤;弃去离心吸附柱,换成离心管,每管加50ul 洗脱液,再次离心1min,-20℃保存备用。

将RNA 反转录成cDNA,反应体系:DEPC 6uL+RNA 5ul+引物1ul+dNTP 2ul,65℃反应2min,在降温至4℃保持5min。再向反应管中加入5*buffer 4ul+Ribolock Rnase Inhibitor 1ul+M-MLV 1ul,30℃反应10min。

三、 引物设计与合成

根据基因文库提供的和已发表的CSFV、PRRSV、PRV、PCV2 和PEDV序列,应用计算机软件DNAstar 在保守区域基因序列保守区的五对引物。该引物设计完成后, 通过计算机网站(http://www.ncbi. Nlm.nih.gov/BLAST/)对其进行分析,结果具有良好的特异性。引物序列如下:CSFV 上游引物:5’-GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG-3’下游引物:5’-TGATGCTGTCACACAGGTGAA-3’PRRSV 上游引物: 5’-GCGGATCCATGCCAAATAACAAC-3’下游引物: 5’-AGCTCGTTTCATGCTGAGGGTGA-3’PRV 上游引物: 5’-AGGACGAGTTCAGCGACG-3’下游引物: 5’-AACAGGCGGTTGGCGGTCAC-3’PCV2 上游引物: 5’-GACCTGTCTACTGCTGTGAGTA-3’下游引物: 5’-AAATTCAGGGCATGGGGGGGAA-3’PEDV 上游引物:5’-GTATGGTATTGAATATACCAC-3’下游引物:5’-GATCCTGTTGGCCATCC-3’

四、 PCR 扩增及鉴定

采用天泽基因PCR 试剂盒,30ul 反应体系:DNA(cDNA) 2-4uL+PCR Mix15ul+引物1-2ul+灭菌双蒸水 9-11ul,采用95℃预变性5min,94℃50s,52-59℃不同温度进行退火50s,72℃延伸1min,共35 个循环;最后72℃延伸10 min,产物4℃保存。

五、 结果与分析

病原分析结果如下(表1.)

仔猪腹泻综合征(NPDS)初步研究

六、预防控制思路

据调查研究显示,我国及东南亚地区目前新生仔猪腹泻高发病率高死亡率与母猪群遭受野毒持续侵染,形成感染压力呈正相关,凡是在重胎期出现一过性腹泻、体况不良、食欲不佳、产程过长、奶水不足、乳房炎与子宫炎及返情、产死胎率高的母猪群所产的新生仔猪发生腹泻病率显著的增高。另外,国内猪场母猪贡献成品肉猪的生产水平普遍不到发达养猪国家的60%,大量的种猪存在不同程度的繁殖障碍,由于母猪的生产性能低下,又加上疾病的频频发生,猪场的盈利危机四伏。在猪场中有着相当多的公猪表现死精、弱精、甚至无精;母猪表现出的屡配不孕、死胎、流产、产弱仔、便秘、奶水不足、采食量不正常等亚临床现象。存在的这些现象中,有超过80%是由于野毒在种猪群中循环并持续侵染种猪的生殖系统上皮细胞,导致卵巢、输卵管、子宫、精囊腺、睾丸等组织器官细胞大量凋亡。

俗话说的好,母猪好好一窝、公猪好好一坡,在重胎期与哺乳期母猪饲喂过程中,采用益百特(肽核酸---一种新型的抗病毒免疫调节功能性添加剂)添加到哺乳母猪料中(产前三周至断奶),对母猪群实施病毒感染良好控制与净化方案是解决如“新生仔猪腹泻综合征(NPDS)”、“母猪繁殖障碍综合征”这些问题的关键!

七、发病猪群临床控治措施

产房新生仔猪腹泻主导病因为受母体病毒感染压力影响,故在处理产房新生仔猪腹泻时不能仅仅针对仔猪用药,必须采用益百特来同时出处理产房母猪和新生仔猪,只有从源头上(饲喂哺乳料料阶段母猪)控制(减少母猪通过胎盘屏障垂直感染胎儿和通过乳汁排毒饲喂乳猪),才能有效控制新生仔猪腹泻,具体措施如下:

A:母猪

A-1:产前三周(通常从换哺乳母猪料)开始添加益百特至断奶,益百特TM (拌

料型或水溶型) 500-800g/吨;

A-2:分娩当天肌注益百特TM 注射液6-8ml/头份,间隔3 天再肌注一次。

B:乳、仔猪

B-1:发病乳、仔猪猪治疗,肌注益百特TM 注射液(按体重20kg/ml)+头孢噻呋钠+阿托品(功能:缓解消化道平滑肌蠕动、止泻),两天一次,连续肌注2-3 次;或益百特TM 注射液 0.2ml+ 霉克乐™ 5-10g/头份灌服(即:以10 头猪/窝计,分别取益百特TM 注射液 2ml 和霉克乐™ 50-100g 加入200ml 热开水中搅拌形成混悬液,用一次注射器吸取20ml 灌入乳猪口中咽下,1-2 次/日。)

B-2:如果某猪场发病规律通常是5 日龄内出现腹泻,那么应予以紧急预防性给药,从仔猪出生当天、3 日龄(即1 日龄、3 日龄),两次各肌注益百特TM 注射液 0.1ml/头份(<3kg 体重);

B-3: 断奶后保育仔猪发生腹泻,能够采食的发病猪群采用益百特TM (拌料型) 1000g+ 君特泰克TM (拌料型) 3000g+霉克乐™3000g/吨全价料,连续饲喂7-10 天或益百特TM (水溶型)500g+ 君特泰克TM (水溶型) 300g+电解多维连续饮水7 天,霉克乐™3000g/吨全价料,连续饲喂7-10 天。

提示:一定要搞好产房环境卫生,保持干燥、温暖。

 来源:猪病新干线  作者:韩健宝 邓小红 
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